檢測(cè)認(rèn)證人脈交流通訊錄
- 生物樣品掃描電鏡常規(guī)掃描電鏡對(duì)樣品要求:必須是干燥的,不含水分或揮發(fā)性物質(zhì);具有一定機(jī)械強(qiáng)度,能耐受電子束轟擊;具有導(dǎo)電性,被激發(fā)時(shí)能夠產(chǎn)生足夠的二次電子。生物材料特點(diǎn):含水分多,質(zhì)地柔軟,機(jī)械強(qiáng)度小;組成元素的原子序數(shù)低,導(dǎo)電性差,激發(fā)后二次電子的產(chǎn)額較少。制樣的任務(wù):通過(guò)一系列處理,既要盡量地保存材料的固有形態(tài),又要改良其物理性能,使其適合在電鏡下觀察成像。
電鏡是進(jìn)行材料表征時(shí)用到一種重要工具,幫助觀察材料的微觀形貌。然而,在觀察軟/濕生物材料時(shí)(離體組織,帶細(xì)胞材料等),涉及到觀察樣品的固定、脫水、干燥、金屬濺射等步驟,處理復(fù)雜,耗時(shí)較長(zhǎng)。
冷凍的水凝膠觀察
生物樣品掃描電鏡的構(gòu)成:
主要四大系統(tǒng):電子光學(xué)系統(tǒng)、信號(hào)收集及顯示系統(tǒng)、真空系統(tǒng)和電源系統(tǒng)。
(1) 電子光學(xué)體系:主要包括電子槍、電磁透鏡、掃描線圈和樣品室等部件。
電磁透鏡:聚焦電子槍束斑,束斑越小,成像單元越小,分辨率越高。
掃描線圈:使電子束偏轉(zhuǎn),在樣品上做光柵狀掃描,激發(fā)多種電子信號(hào)。
樣品室:放置樣品,并安裝有各種信號(hào)探測(cè)器。
?。?)信號(hào)收集及顯示系統(tǒng):收集樣品在入射電子束作用下產(chǎn)生的各種信號(hào),二次電子、背散射電子、特征X射線等,并進(jìn)行放大轉(zhuǎn)換顯示在顯示系統(tǒng)上像。
?。?)真空系統(tǒng):場(chǎng)發(fā)射電子顯微鏡的電子槍需要高真空度,所以配有2臺(tái)離子泵,1臺(tái)分子泵和一臺(tái)機(jī)械抽空泵。
?。?)電源系統(tǒng):包括啟動(dòng)的各種電源,檢測(cè)-放大系統(tǒng),真空系統(tǒng)和成像系統(tǒng)等。
分辨率的下降,掃描樣品在干燥過(guò)程中,由于失去水分會(huì)造成組織和細(xì)胞結(jié)構(gòu)發(fā)生皺縮。此外,液體巨大的表面張力,將對(duì)細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)產(chǎn)生嚴(yán)重的影響。因此,生物樣品的干燥是掃描制備中的關(guān)鍵。樣品觀察表面必須具有良好的導(dǎo)電性和較高的二次電子發(fā)射率
生物樣品掃描電鏡掃描圖像的質(zhì)量與樣品受激發(fā)產(chǎn)生的二次電子的多少有很大的關(guān)系。對(duì)于一幅由10°個(gè)像素組成的圖像,生物樣品掃描電鏡掃描探針在樣品的每個(gè)掃描點(diǎn)上要產(chǎn)生平均6個(gè)二次電子,對(duì)于生物樣品,一般只能產(chǎn)生0.1~2個(gè)二次電子,使得圖像的質(zhì)量與分辨率均受到影響。另一方面由于生物樣品的導(dǎo)電性較差,入射電子在樣品表面堆積,容易形成充放電現(xiàn)象,造成忽亮忽暗、全黑全白、圖像錯(cuò)位等反常圖像。因此,提高樣品的導(dǎo)電性、消除充放電效應(yīng)和增強(qiáng)二次電子發(fā)射率是生物樣品掃描制備的另一個(gè)基本要求。
低真空下電鏡觀察葉子氣孔
是在真空狀態(tài)下觀察樣品的表面形態(tài)。而生物樣品主要特點(diǎn)是含水量多,脫水干燥過(guò)程中容易收縮變形;大多數(shù)生物組織由碳、氫、氧、磷、鉀等原子序數(shù)較低的元素組成,不易激發(fā)二次電子,導(dǎo)電性較差。因此制備的樣品要求滿足以下條件。
1.樣品觀察表面必須真實(shí)
樣品觀察表面必須保持其在活休狀態(tài)時(shí)的形貌。在樣品處理中要去掉覆蓋在表面的灰塵、粘液、蠟質(zhì)等雜質(zhì)。此外,取樣時(shí)避免機(jī)械損傷。
2.樣品必須干燥且不變形
含水的生物樣品在真空條件下極易揮發(fā),因此,在掃描觀察時(shí)樣品必須干燥,以防水分的蒸發(fā)影響儀器的真空度
注意事項(xiàng):
1.細(xì)菌和真菌的處理方法與細(xì)胞一樣,但固定時(shí)間需延長(zhǎng)(幾小時(shí)甚至過(guò)夜);
2.在樣品制備的過(guò)程中應(yīng)始終保持樣品濕潤(rùn),切勿讓樣品干裂;
3.由于掃描電鏡觀察樣品表面,因此一定要沖洗干凈樣品表面的殘余雜質(zhì);
4.較大樣品需將樣品切成片狀,厚度不超過(guò)2-3mm。
一、取樣:
選取觀察材料需根據(jù)材料的特性與觀察目的的不同,采取不同的方法。取樣的基本要求:取材動(dòng)作迅速;取材部位準(zhǔn)確;固定及時(shí);避免機(jī)械損傷。體積的大小沒(méi)有太大的限制,觀察表面的面積通常不超過(guò)10mm×10mm,厚度約兒個(gè)毫米。對(duì)于一些微小的單體材料(如游離細(xì)胞、細(xì)菌、線蟲(chóng)等),取樣時(shí)應(yīng)注意材料數(shù)量要取夠,防止在制備過(guò)程中由于丟失造成材料不足而影響觀察。對(duì)于樣品斷裂面的獲取最好采用冷凍斷裂的方法。
二、清洗:
樣品的清洗主要有二個(gè)作用。其一是用清洗液除去樣品觀察表面的雜質(zhì)或異物,其二是用緩沖液清洗掉沒(méi)有與樣品結(jié)合的固定劑。
用清洗液清洗去除樣品表面的灰塵、粘液、油脂、蠟質(zhì)等,可使樣品表面充分暴露。清洗液有雙蒸水、生理鹽水、含酶的清洗液、各種緩沖液、有機(jī)溶劑等。清洗的方法可采用氣吹、沖洗、刷洗、超聲波清洗等方法。清洗過(guò)程中要避免對(duì)樣品表面細(xì)微結(jié)構(gòu)損傷。清洗的具體做法可根據(jù)研究l的、樣品性質(zhì)和樣品對(duì)環(huán)境變化的敏感程度選用不同的清洗液和清洗方法。
三、固定
固定的目的是利用固定劑保存樣品細(xì)胞內(nèi)的各種成分和結(jié)構(gòu),使它盡可能接近活體狀態(tài)。固定的方法的是戊二醛——餓酸雙固定,其中餓酸固定還具有增加組織的導(dǎo)電性的作用。對(duì)一些觀察倍數(shù)要求不是很高的材料,可只用戊二醛單固定。對(duì)一些形態(tài)結(jié)構(gòu)不易發(fā)生變化的材料(如種子、某些花粉、孢子等),甚至可以不用固定。固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)的真菌、菌絲之類的材料,可用餓酸蒸氣薰蒸加以固定。培養(yǎng)細(xì)菌的菌毛在取樣之前,可先加入戊二醛固定。
固定劑的種類、配制方法、固定時(shí)間和操作條件及要求與透射電鏡樣品固定處理基木相同。
四、脫水
掃描電鏡樣品脫水的目的是用脫水劑取代樣品中的游離水,為了使樣品在干燥過(guò)程中,避免樣品中水分直接蒸發(fā)時(shí)產(chǎn)生巨大的表面張力(水的表面張力在20℃時(shí)達(dá)46000kg/cm3),使樣品結(jié)構(gòu)遭到損傷。常用的脫水劑是乙醇和丙酮,采用等梯度系列脫水的方法,脫水時(shí)間間隔5~15分鐘。在100%脫水劑中要過(guò)2~3次。
螨蟲(chóng)自然風(fēng)干電鏡直接觀察
選擇電鏡
1、如果需要研究樣品的內(nèi)部結(jié)構(gòu),例如細(xì)胞器的改變,則應(yīng)選擇透射電鏡觀察
2、如果需要研究樣品表面的形態(tài)結(jié)構(gòu),如細(xì)胞的外形、細(xì)胞的生長(zhǎng)形態(tài)等,則應(yīng)選擇掃描電鏡觀察
生物樣品取材、固定、保存
1、透射電鏡樣品:
1) “快速":指盡量在活體條件下取材或動(dòng)物斷血后2分鐘內(nèi)取材,并迅速將組織放入電鏡專用3.5%戊二醛固定液內(nèi)(不可用酒精或消毒級(jí)戊二醛固定),并于4℃冰箱內(nèi)保存,切忌樣品結(jié)冰。
2) “準(zhǔn)確":指取材部位要準(zhǔn)確。取材的器械要鋒利,盡量減少對(duì)組織的牽拉和擠壓。
3) “體積小、低溫":指組織厚度不應(yīng)大于3mm,取材溫度最好控制在4℃左右進(jìn)行操作。
2、掃描電鏡樣品
1) 取材時(shí)還應(yīng)盡量保護(hù)觀察面,避免用鑷子夾持觀察區(qū)域,在固定前,通常應(yīng)用適當(dāng)?shù)那逑匆呵逑礃悠繁砻娴碾s質(zhì),灰塵,粘液等附著物。
2) 常用的清洗波有蒸餾水、生理鹽水、各種緩沖液或含酶的清洗液。
3) 樣品取好后,放入3.5%戊二醛固定液內(nèi)固定,保存在4℃冰箱中,切忌樣品結(jié)冰。
流程
1、透射電鏡
取樣——3.5%戊二醛前固定;1%鐵酸后固定——酒精、丙酮逐級(jí)梯度脫水——Epon-618滲透、包理——半薄切片——光鏡選區(qū)定位——修塊——超薄切片機(jī)切片——檸檬酸鉛、醋酸鈾雙染色——透射電鏡觀察——攝片——分析+報(bào)告
2、掃描電鏡樣品
1) 取材——清洗——固定——冷凍——SEM觀察(冷凍電鏡)
2) 取材——清洗——固定——脫水——干燥——鍍膜——SEM觀察(常規(guī)檢測(cè))
3) 取材——清洗——固定——組織導(dǎo)電處理——脫水——SEM觀察(特殊樣品,例如外泌體)
生物樣品掃描電鏡http://www.yuxiubio.com/Products-33656721.html
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南京科捷分析儀器有限公司
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