上海遠(yuǎn)慕生化試劑廠家詳細(xì)講述HEPES緩沖鹽溶液(2×HeBS,pH7.05)的操作方法，注意事項(xiàng)及其他咨訊說明等，作為專業(yè)的生化試劑供應(yīng)商，我司所供應(yīng)的緩沖液品種齊全，價(jià)格實(shí)惠，品種包含：磷酸鹽緩沖液，原生質(zhì)體緩沖液，包涵體裂解緩沖液，植物電穿孔緩沖液，DNA中和緩沖液Ⅱ，脫氧核糖核酸緩沖液，更多緩沖液請來電咨詢！

HEPES緩沖鹽溶液(2×HeBS,pH7.05) 說明書

【操作方法】

1、 在轉(zhuǎn)染前24h用蛋白酶消化培養(yǎng)細(xì)胞，取適量數(shù)期細(xì)胞轉(zhuǎn)移至新的培養(yǎng)器皿中，使細(xì)胞在轉(zhuǎn)染時(shí)生長狀態(tài)良好。

2、 在加入DNA之前2～4h,按9ml/10cm培養(yǎng)皿的比例加入完全培養(yǎng)液,置于37℃5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)。

3、 取適量乙醇沉淀的DNA溶解于無菌水中，加入50μl 2.5M CaCl2，并充分混勻，使Ca2+終濃度達(dá)到0.25M。

4、 用移液器一邊吹打2×HeBS,一邊逐滴加入配制好的CaCl2溶液(操作應(yīng)迅速，一般在30～60s)，并劇烈振蕩5s，室溫下靜置以形成沉淀。

5、 取沉淀均勻加入到培養(yǎng)皿細(xì)胞中，輕輕晃動使沉淀于培養(yǎng)液充分混勻，置于37℃ 5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)。

6、 去除培養(yǎng)液，用PBS清洗細(xì)胞2次，加入5完全培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)。

7、 對于瞬時(shí)轉(zhuǎn)染，在轉(zhuǎn)染的不同時(shí)間點(diǎn)內(nèi)收集細(xì)胞并檢測，一般時(shí)間多控制在12～60h以內(nèi)。

8、 對于穩(wěn)定轉(zhuǎn)染，轉(zhuǎn)染后在非選擇性培養(yǎng)液培養(yǎng)，一般時(shí)間多控制在24～36h，以便外源基因表達(dá)。

9、 用胰蛋白酶消化細(xì)胞并傳代，更換適當(dāng)?shù)倪x擇培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)，沒2～4d更換一次選擇培養(yǎng)液，一般10～14d會出現(xiàn)目的細(xì)胞克隆。

【注意事項(xiàng)】

1、注意無菌操作,盡量避免污染。

2、對于瞬時(shí)轉(zhuǎn)染,可以不用乙醇沉淀的DNA。

3、休克處理某些細(xì)胞系會使轉(zhuǎn)染效率大大提高,但應(yīng)注意甘油暴露過久易導(dǎo)致細(xì)胞死亡。

4、轉(zhuǎn)染12～24h后,可以加入終濃度為10mmol/L的丁酸鈉溶液,可以提高病毒滴度。

5、該試劑用于轉(zhuǎn)染時(shí)應(yīng)檢測其轉(zhuǎn)染效率,好的轉(zhuǎn)染效率應(yīng)介于30～60%之間。

6、為了您的安全和健康,請穿實(shí)驗(yàn)服并戴一次性手套操作。

【簡介說明】

HEPES緩沖鹽溶液(2×HeBS,pH7.05)外源基因?qū)胝婧思?xì)胞的方法有很多種，如磷酸鈣轉(zhuǎn)染法、DEAE-葡聚糖轉(zhuǎn)染法、脂質(zhì)體法、電穿孔法、顯微注射法等。HEPES緩沖鹽溶液(2×HeBS)是一種常用的細(xì)胞轉(zhuǎn)染溶液，主要由HEPES、氯化鈉、磷酸鹽等組成，其最適pH值為7.05～7.12，經(jīng)過濾除菌處理。

影響磷酸鈣轉(zhuǎn)染效率的因素主要有沉淀中DNA含量、DNA在細(xì)胞上停留的時(shí)間、休克時(shí)間。Leagene 2×HeBS要求DNA濃度在10～50μg為宜，Hela、BALB等細(xì)胞沉淀放置16h。

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