體外哺乳動(dòng)物細(xì)胞染色體畸變?cè)囼?yàn) ISO10993研究基地中科院上海分院，地址：上海市江場(chǎng)西路395號(hào)。項(xiàng)目帶頭人：黃工13764818040
體外哺乳動(dòng)物細(xì)胞染色體畸變?cè)囼?yàn)

In Vitro Mammalian Cells Chromosome Aberration Test

1 范圍

本規(guī)范規(guī)定了體外哺乳動(dòng)物細(xì)胞染色體畸變?cè)囼?yàn)的基本原則、要求和方法。 本規(guī)范適用于檢測(cè)化妝品原料及其產(chǎn)品的致突變性。

2 規(guī)范性引用文件

OECD Guidelines for Testing of Chemicals ( No.473, July 1997)

3 試驗(yàn)?zāi)康?/p>

本試驗(yàn)是用于檢測(cè)培養(yǎng)的哺乳動(dòng)物細(xì)胞染色體畸變，以評(píng)價(jià)受試物致突變的可能性。 4 定義

染色體型畸變(Chromosome-type aberration)：染色體結(jié)構(gòu)損傷，表現(xiàn)為在兩個(gè)染色單體相同位點(diǎn)均出現(xiàn)斷裂或斷裂重組的改變。

染色單體型畸變(Chromatid-type aberration)：染色體結(jié)構(gòu)損傷，表現(xiàn)為染色單體斷裂或染色單體斷裂重組的損傷。

染色體數(shù)目改變(Numerical aberration)：所用細(xì)胞株的正常染色體數(shù)目的變化。

結(jié)構(gòu)畸變(Structural aberration)：在細(xì)胞分裂的中期相階段，用顯微鏡檢出的染色體結(jié)構(gòu)改變，表現(xiàn)為缺失、斷片、互換等。

有絲分裂指數(shù)(Mitotic index)：中期相細(xì)胞數(shù)與所觀察的細(xì)胞總數(shù)之比值；是一項(xiàng)反映細(xì)胞增殖程度的指標(biāo)。

5 試驗(yàn)基本原則

在加入和不加入代謝活化系統(tǒng)的條件下，使培養(yǎng)的哺乳動(dòng)物細(xì)胞暴露于受試物中。用中期分裂相阻斷劑（如秋水仙素或秋水仙胺）處理，使細(xì)胞停止在中期分裂相，隨后收獲細(xì)胞，制片，染色，分析染色體畸變。

6 試驗(yàn)方法

6.1 試劑和受試物制備

6.1.1 陽(yáng)性對(duì)照物：可根據(jù)受試物的性質(zhì)和結(jié)構(gòu)選擇適宜的陽(yáng)性對(duì)照物，陽(yáng)性對(duì)照物應(yīng)是已知的斷裂劑，能引起可檢出的、并可重復(fù)的陽(yáng)性結(jié)果。當(dāng)外源性活化系統(tǒng)不存在時(shí)，可使用甲磺酸甲酯（methyl methanesulphonate (MMS)）、甲磺酸乙酯（ethyl methanesulphonate(EMS)）、乙基亞硝基脲(ethyl nitrosourea)、絲裂霉素C(mitomycin C)、4-硝基喹啉-N-氧化物（4-nitroquinoline-N-oxide）。當(dāng)外源性活化系統(tǒng)存在時(shí)，可使用苯并（a）芘[benzo(a)pyrene]、環(huán)磷酰胺(cyclophosphamide)。

6.1.2 陰性對(duì)照物：應(yīng)設(shè)陰性對(duì)照，即僅含和受試物組相同的溶劑，不含受試物，其它處理和受試物組完全相同。此外，如未能證實(shí)所選溶劑不具有致突變性，溶劑對(duì)照與本實(shí)驗(yàn)室空白對(duì)照背景資料有明顯差異，還應(yīng)設(shè)空白對(duì)照。 6.1.3 受試物

6.1.3.1 受試物的配制：固體受試物需溶解或懸浮于溶劑中，用前稀釋至適合濃度；液體受試物可以直接加入試驗(yàn)系統(tǒng)和/或用前稀釋至適合濃度。受試物應(yīng)在使用前新鮮配制，否則就必

須證實(shí)貯存不影響其穩(wěn)定性。

6.1.3.2 溶劑的選擇：溶劑必須是非致突變物，不與受試物發(fā)生化學(xué)反應(yīng)，不影響細(xì)胞存活和S9活性。首選溶劑是培養(yǎng)液（不含血清）或水。二甲基亞砜（DMSO）也是常用溶劑，使用時(shí)濃度不應(yīng)大于0.5%。 6.1.3.3 受試物濃度設(shè)置

（1） 最高濃度的選擇：決定最高濃度的因素是細(xì)胞毒性、受試物在試驗(yàn)系統(tǒng)中的溶

解度以及pH或滲克分子濃度(osmolality)的改變。

（2） 細(xì)胞毒性的確定：應(yīng)使用指示細(xì)胞完整性和生長(zhǎng)情況的指標(biāo)，在活化系統(tǒng)存在

或不存在的兩種條件下確定細(xì)胞毒性，例如細(xì)胞覆蓋程度（degree of confluency）、存活細(xì)胞計(jì)數(shù)(viable cell counts)或有絲分裂指數(shù)(mitotic index)。應(yīng)在預(yù)試驗(yàn)中確定細(xì)胞毒性和溶解度。

（3） 劑量設(shè)置：①至少應(yīng)設(shè)置3個(gè)可供分析的濃度。當(dāng)有細(xì)胞毒性時(shí)，其濃度范 圍應(yīng)包括從最大毒性至幾乎無(wú)毒性；通常濃度間隔系數(shù)不大于 2 ~。

②在收獲細(xì)胞時(shí)，最高濃度應(yīng)能明顯降低細(xì)胞覆蓋程度、細(xì)胞計(jì) 數(shù)或有絲分裂指數(shù)（均應(yīng)大于50%）。

③對(duì)于那些相對(duì)無(wú)細(xì)胞毒性的化合物，最高濃度應(yīng)是5μl/mL， 5mg/mL或0.01mol/L。

④對(duì)于相對(duì)不溶解的物質(zhì)，當(dāng)濃度低于不溶解濃度時(shí)仍無(wú)毒性， 則最高劑量應(yīng)是，當(dāng)處理期結(jié)束時(shí)，在最終培養(yǎng)液中溶解度限 值以上的一個(gè)濃度。在某些情況下（即僅當(dāng)高于最低不溶解濃 度時(shí)才發(fā)生細(xì)胞毒性），應(yīng)使用一個(gè)以上可看見沉淀的濃度。最 好在試驗(yàn)處理開始和結(jié)束時(shí)均評(píng)價(jià)溶解度，因?yàn)橛捎诩?xì)胞、S9 等的存在，在試驗(yàn)系統(tǒng)內(nèi)在暴露過(guò)程中溶解度可能變化。不溶 解性可用肉眼鑒別，但沉淀不能影響觀察。

6.1.4 培養(yǎng)液：采用MEM(Eagle)，并加入非必需氨基酸和抗菌素（青、鏈霉素，按100IU/mL），胎牛血清或小牛血清按10%加入。也可選用其它合適的培養(yǎng)液。 6.1.5 活化系統(tǒng)

通常使用的是S9混合物（S9 mix）。S9是從經(jīng)酶誘導(dǎo)劑（Aroclor 1254或苯巴比妥鈉和β-萘黃酮聯(lián)合使用）處理的嚙齒動(dòng)物肝臟獲得的。S9的制備同Ames試驗(yàn)。S9的使用濃度為1%~10%（終濃度）。S9 mix中所加輔助因子的量由各實(shí)驗(yàn)室自行決定，但需對(duì)S9mix的活性進(jìn)行鑒定，必須能明顯活化陽(yáng)性對(duì)照物。也可使用下述

S9

MgC12 （0.4 mol/L） KC1（1.65mol/L） 葡萄糖-6-磷酸

輔酶Ⅱ（氧化型，NADP） 用無(wú)血清MEM培養(yǎng)液補(bǔ)足至1mL.

6.2 試驗(yàn)步驟

6.2.1 細(xì)胞：使用中國(guó)地鼠卵巢（CHO）細(xì)胞株或中國(guó)地鼠肺（CHL）細(xì)胞株。 6.2.2 試驗(yàn)時(shí)，應(yīng)同時(shí)設(shè)陽(yáng)性對(duì)照物，陰性對(duì)照物和至少3個(gè)可供分析的受試物濃度組。 6.2.3 試驗(yàn)前一天，將一定數(shù)量的細(xì)胞接種于培養(yǎng)皿（瓶）中，放CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。 6.2.4 試驗(yàn)需在加入和不加入S9 mix的條件下進(jìn)行。試驗(yàn)時(shí)，吸去培養(yǎng)皿（瓶）中的培養(yǎng)液，

0.125ml 0.02 ml 0.02 ml 1.791mg 3.0615mg

加入一定濃度的受試物、S9 mix（不加S9 mix時(shí)，需用培養(yǎng)液補(bǔ)足）以及一定量不含血清的培養(yǎng)液，放培養(yǎng)箱中處理2h~6h。結(jié)束后，吸去含受試物的培養(yǎng)液，用Hanks液洗細(xì)胞3次，加入含10%胎牛血清的培養(yǎng)液，放回培養(yǎng)箱，于24h內(nèi)收獲細(xì)胞。于收獲前2h~4h，加入細(xì)胞分裂中期阻斷劑（如用秋水仙素，作用時(shí)間為4h，終濃度為1μg/mL）。

當(dāng)受試物為原料時(shí), 如果在上述加入和不加入S9 mix的條件下均獲得陰性結(jié)果，則尚需補(bǔ)加另外的試驗(yàn)，即在不加S9 mix的條件下，使受試物與試驗(yàn)系統(tǒng)的接觸時(shí)間延長(zhǎng)至24h。 當(dāng)難以得出明確結(jié)論時(shí)，應(yīng)更換試驗(yàn)條件，如改變代謝活化條件、受試物與試驗(yàn)系統(tǒng)接觸時(shí)間等重復(fù)試驗(yàn)。

6.2.5 收獲細(xì)胞時(shí)，用0.25%胰蛋白酶溶液消化細(xì)胞，待細(xì)胞脫落后，加入含10%胎?；蛐∨Ｑ宓呐囵B(yǎng)液終止胰蛋白酶的作用，混勻，放入離心管以1000r/min~1200r/min的速度離心5min~7min，棄去上清液，加入0.075mol/L KC1溶液低滲處理，繼而以新配制的甲醇和冰醋酸液（容積比為3:1）進(jìn)行固定。按常規(guī)制片，用姬姆薩染液染色。

6.2.6 作染色體分析時(shí)，對(duì)每一處理組選200個(gè)（陽(yáng)性對(duì)照可選100個(gè)）分散良好的中期分裂相（染色體數(shù)為2n±2）進(jìn)行染色體畸變分析。在分析時(shí)應(yīng)記錄每一觀察細(xì)胞的染色體數(shù)目，對(duì)于畸變細(xì)胞還應(yīng)記錄顯微鏡視野的坐標(biāo)位置及畸變類型。

6.3 統(tǒng)計(jì)處理：對(duì)染色體畸變細(xì)胞率用X2檢驗(yàn)，以評(píng)價(jià)受試物的致突變性。 6.4 結(jié)果評(píng)價(jià)：在下列兩種情況下可判定受試物在本試驗(yàn)系統(tǒng)中具有致突變性： （1）受試物引起染色體結(jié)構(gòu)畸變數(shù)的增加具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，并有與劑量相關(guān)的增加。 （2）受試物在任何一個(gè)劑量條件下，引起具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，并有可重復(fù)性的陽(yáng)性反應(yīng)。

在評(píng)價(jià)時(shí)應(yīng)把生物學(xué)和統(tǒng)計(jì)學(xué)意義結(jié)合考慮。

7 試驗(yàn)報(bào)告

試驗(yàn)報(bào)告應(yīng)包括以下內(nèi)容：

（1）受試物名稱、有關(guān)的理化性狀、所用溶劑及其配制、劑量選擇（應(yīng)說(shuō)明受試物對(duì)細(xì)胞毒

性的測(cè)定方法、溶解情況等）; （2）細(xì)胞株名稱; （3）實(shí)驗(yàn)條件和方法

①代謝活化系統(tǒng)：制備S9時(shí)所用酶的誘導(dǎo)劑、選用的動(dòng)物品種和來(lái)源、S9mix的配方； ②對(duì)照物：陽(yáng)性對(duì)照物名稱和選用濃度；陰性（溶劑）對(duì)照物名稱及使用濃度。 ③培養(yǎng)液：所用培養(yǎng)液名稱、血清類別和使用濃度； ④接種時(shí)的細(xì)胞密度以及所用培養(yǎng)皿（瓶）的規(guī)格； ⑤中期分裂阻斷劑：名稱、所用濃度、作用時(shí)間； ⑥處理時(shí)間：受試物與試驗(yàn)系統(tǒng)的接觸時(shí)間；

⑦簡(jiǎn)述制片方法、分析的中期分裂相數(shù)目、結(jié)果評(píng)價(jià)方法。 （4）結(jié)果

①受試物最高劑量的確定及試驗(yàn)結(jié)果：細(xì)胞毒性的測(cè)定（建議的表格見表1）；溶解情況

（建議的表格見表2）；對(duì)pH和滲克分子（osmolality）濃度的影響（如果有影響）。 ②各處理組和對(duì)照組染色體畸變率（建議的表格見表3）。

③本實(shí)驗(yàn)室的陽(yáng)性對(duì)照組和陰性對(duì)照組（常用溶劑，如DMSO）在本實(shí)驗(yàn)室歷史上的染

色體畸變率范圍、均值和標(biāo)準(zhǔn)差（說(shuō)明樣品數(shù)）。 （5）結(jié)論。

表1 受試物對(duì)細(xì)胞的毒性

表2 受試物在所選溶劑中溶解情況記錄

表3 受試物的檢測(cè)結(jié)果

組 別 陰性對(duì)照 受試物

陽(yáng)性對(duì)照

終濃度μg/mL

觀察細(xì)胞數(shù) +S9 -S9

畸變細(xì)胞數(shù) +S9 -S9

畸變率（%） +S9 -S9

8 結(jié)果解釋

陽(yáng)性結(jié)果表明受試物引起培養(yǎng)的哺乳動(dòng)物體細(xì)胞染色體結(jié)構(gòu)畸變。

陰性結(jié)果表明在本試驗(yàn)條件下，受試物不引起培養(yǎng)的哺乳動(dòng)物體細(xì)胞染色體結(jié)構(gòu)畸變。
 涉及地區(qū)：廣東省、浙江省、福建省、海南省、云南省、廣西省、貴州省、新疆省、四川省、重慶市、西藏省、湖南省、江西省、湖北省、上海市、北京市、天津市、安徽省、江蘇省、甘肅省、寧夏省、內(nèi)蒙古省、黑龍江省、吉林省、遼寧省、山東省、陜西省、山西省、河南省、河北省